Síguenos en:   
Menu
X

Nuevas herramientas para avanzar en la genética de enfermedades prevalentes de la infancia: Diabetes tipo I y enfermedad celíaca

GenéticaHaurtzaroaren gaixotasun gailentasunaren genetikan aurreratzeko tresna berriak: Diabetes mota I eta Gaixotasun Zeliakoa

José Ramón Bilbao Catalá

Endokrinologia eta Diabetesaren Ikerkuntza Saila

Inmunogenetikaren Laborategia

Gurutzetako Ospitalea.

Barakaldo- BIZKAIA

rbilbao@hcru.osakidetza.net

tel: 946006376

Sarrera

Gaixotasun konplexuak kausatzen dituzten genetako identifikazioa (ingurugiroaren akzioaren eraginez alde-aurretiko joera duten subjektuetan agertzen direnak) erronka garrantzitsua da, patalogia hauek garatu ahal duten gizabanakoak hautatu ahal izateko, eta modu honetan zenbait arrakasta berme dituzten prebentzio terapiak aplikatu ahal izateko. Zeregin honek garrantzi handiagoa hartzen du, eri-heriotza handiagoa dituzten patologia kronikoen kasuan eta  bizitzan zehar sor daitezkeen zailtasun arrisku altuaren kasuan. Mellitus mota 1eko diabetesa (DM1) egoera honetako adibide ona da: terapia sendatzaileen, hala nola, uharte-pankreatikoen transplantatzea edota ingeniaritza zelularraren intsulina sortzen dituzten zelula-ametatik ateratako zelulek klinikoki aplikatzeko garapen nahikoa izatearen menpe  daude. Gaixotasunaren prebentzioa helburu garrantzitsua izaten jarraitzen du. Prebentzio sekundarioaren saioek (zelula ß pankreatikoaren hondamendi autoinmunotasun prozesua behin hasiz gero)  gaixotasunaren markagailu inmunologikoak adierazten dituzten aurre-diabetiko gizabanakoek, ordea, (anti-intsulina antigorputzak eta anti-uharte zirkulatzaileak) ez-eraginkorrak adierazi egin dira. Honek, iragarpen tresna oraindik goiztiarragoekin kontatzea iradokitzen du, modu honetan, arrisku genetikoaren (autoinmunitatea) biztanleria dianan eman daitekeen manifestazio fenotipikoa oraindik hasi ez denean identifikatu ahal izateko.

Gaixotasun Zeliakoa (GZ) edo glutenarekiko intolerantzia, haurtzaroan agertzen den beste gaixotasun kronikoa da. DM1 baino onberagoa izanda ere, bizieraren aldaketa garrantzitsuak suposa ditzake (glutenik gabeko dieta) eta zailtasun handiagoak ere ager daiteke pertsona heldu batean, GZ diagnostikatzen ez bada (modu isil eta ezkutuetan) baita glutenik gabeko dietara berrezarpen jarraituak egiten badira. Hain zuzen ere, GZ ez diagnostikatu (edo ez tratatu) baten ondorio posibleen artean, DM1a bera egongo litzateke. Gure taldearen ikerketa batek demostratzen zuen nola diabetes mota 1 azaltzen zuten pazienteen %7ak GZ ez diagnostikatu bat sufritzen zuten, DM1 debutaren momentuan.

Sistema eta organo espezifikoei hunkitu arren, DM1 eta GZ sistema inmunologikoaren nahasmenduak dira, non organismoak bereko estrukturak mintzen dituen, hauen hondamendia probokatuz. Fisiopatologia arrunt honek, bi entitate hauen arteko elkartasuna azalduko luke, eta osagarri heredagarri bat eramaten dituzten gaixotasunez hitz egiten ari garenez,  faktore genetiko arruntek, hauek sufritzeko berezko arriskua azalduko lukete. Izan ere, orain dela denbora asko ezagutu izan da, bi gaixotasunen minberatasun genetikoaren determinagarri garrantzitsuenak, Histo-bateragarritasun Konplexu Nagusian (MHC)n aurkitzen direla; kromosoma 6p21ean. Kromosoma honek, gutxi gora behera, diabetes autoinmunearen %40ko heredagarritasunaren arduraduna izango litzateke, eta gutxienez GZaren %30arena.  Biztanleria Kaukasiarrean, HLA-DRB1*0301 eta HLA-DRB1*04 aleloek (DR3 eta DR4 hurrenez hurren), DM1 sufritzeko arrisku handiena suposatzen dute. Alelo hauek estuki lotuak daude HLA-DQ2 eta HLA-DQ8 kodifikatzen dituzten molekulei, eta GZ garatzeko arriskuarekin erlazionatzen dira. Hala ere, haplotipo hauek gaixotasun hauek garatzen ez duen biztanleriaren artean baita aurkitzen dira. Honek esan nahi du, badaudela DM1 eta GZ garatzeko joera duten beste gene batzuk. Bi azken hamarkadetan, minberatasun gene hauek aurkitzeko ahalegin handiak egin dira, baina emaitzak ez dira guztiz egokiak izan eta gaixotasun autoinmuneen garapena oso mugatuta jarraitzen du.

Gaur egun, aurrerapen teknologikoak aprobetxatzen dituzten aukera berriak aplikatzen ari dira, microarraysen genoma osoaren adierazpen genetikoaren Ikerketan, Genotipatu masiboan eta Bioinformatikan, pertsonaren geneen aztertzea optimizatzeko.

Minberatasun geneak aztertzeko estrategia klasikoak:

DM1 era GZak jarraitzen duen patroiak ez dela eredu mendeliar klasikoei moldatzen, eta familia bakoitzean emandako kasuak eskasak direla kontutan izanda, gaixotasun monogeniko edota Mendeliarrak aztertzeko erabili izan diren ligamendu klasikoen azterketak diseinatzea ezinezkoa da. Azken urteetan, funtsezko bi estrategia mota erabili izan dira:

Gene hautagaien estrategia: Bilaketa gidatu edo gaixotasunarekin erlazionaturiko alterazio genetiko potentzialei hesitua. Mekanismo patogenikoen aurretiko jakintzei edota gaixotasunean jarduten duten bide metabolikoei dagokienez, hainbat hautagai posibleak aukeratu egiten dira eta markagailu polimorfikoen elkarketaren ikerketak egiten dira. Estrategia honek eman nahi duen erantzuna honela formulatu daiteke: biztanleria orokorrera dagokionez, gene hautagaiaren edozein alelok handiagotu egiten ari dira? Bere bertsio errazenean, kasu eta kontrolen diseinu bat erabiltzen da, bi taldeetako bariante determinatu baten frekuentzia konparatuz. Gaur eguneko biztanlerien hazkuntzaren konplexutasunaren ondorioz eta jatorri etniko ezberdinen kasuen geruzapen genetikoen arteko elkarteak ekiditeko, AFBAC (Affected Family Based Controls) ikerketa familiarrengana jotzea gomendagarria da, non familia nuklear baten lau alelo parentalek (hautatutakoa eta bere gurasoek), gaixoari ez igorritako bi aleloek, kontrol genotipo bezala erabiliak izaten diren. Beste adibide bat, TDTa (Transmisión Disequilibium Test) da, non familia talde baten barruan, aleloa hautaturikoari igortzen zaion. Honela, %50eko proportzio teorikoarekiko konparaketa ezartzen den.  Edozein ezberdintasun alelo baten frekuentzian talde gaixoen barruan edota alelo horren kontrola edota transmisio proportzioa neutraltasunetik desbideratua, bariazio genetiko hori sufritzeko minberatasunaren ebidentzia bezala hartzen da.

Mapeo genomikoaren ikerketak: Estrategia honek, jatorri genomikoa (banda kromosomikoa arrunki) aztertzeko ahaleginak burutzen ditu; non gaixotasunean inplikaturiko genea aurkitzen den. Prozesu hau, hainbat familia kide gaixoen genoma osoaren analisi sistematiko batean oinarritzen da. Horretarako, DNAko hainbat segmentu oso aldakorrak (poliformikoak) erabiliz. Hauen kokaleku zehatza ezagutzen da (markagailuak). Hurbilketa zehatzena, maiztasun handiagoarekin erabili izan dena izan da; anai gaixoak bikoteka aztertzen dira (affected sib-pairs), modu honetan, gaixotasun genetikoaren zoriz estimatzen den baino gradu handiagoa existitzen den frogatzeko. Komenigarria da gaixotasunarentzako gene neutro baten kasuan, %25eko anaiek bi aleloak partekatzen dituzte, %50ak bietako bat konpartitzen dute, eta gainerako %25a ez du alelorik konpartitzen. Proportzio hauetako edozein desbideratzek, markagailu polimorfiko ikertuak gaixotasunarekin loturiko gene baten hurbil egongo lukeela suposatzen du. ikerketa hauen abantaila handiena, ikerlariak mekanismo etiologiko eta bide metabolikoen informazio eza eduki ahal duela, eta modu honetan, hautatuak zoriz aukeratzea.

Bi hurbilketa hauek hainbatetan erabiliak izan dira urte hauetan zehar, eta DM1 eta GZaren gaixotasunen genetika hobeto ulertzea baimendu izan digu. Argitaratuak izan diren lan askoren artean, DM1ekin kutsaturiko bi anaien lehenengo ekorketa genomikoa aurkitzen da. Hau, J.A. Todd irakaslearen taldearengatik eginda izan zen, 1994 urtean. Bertan, genomaren 17 eskualde aurkitu ziren (IDDM1-IDDM17 izendaturikoak). Hauetan, DM1 kausatzen duten geneak aurkitzen direla estimatzen da. Lan hau, microsateliteak genotipatzen egin zen (DNAko sekuentzia ez kodifikatuak, bi edo hiru nukelotidoen errepikatzeengatik sortuak. Bere luzera (errepikapenen zenbakia) aldakorra da, biztanlerian aldakuntza edota alelo ezberdinak agertuz). Honek, gizabanakoak identifikatu eta konparatzeko tresna baliagarrietan bihurtzen ditu (gaixoak kontrolen aurren, esate baterako). Deskribaturiko mapeo genomikoaren ikerketak bezala, 400 mikrosatelite inguruan erabiltzen dituzte; 10zM ko banaketa ezarriz haien artean. Honek, laborategiko lan gogoangarria erakartzen du.

Beranduago, ikerketa hauen erreplikak egin izan dira herrialde berezituetan, eta gene hautatuen erlazioaren ikerketen bidez, herrialde horien gene posibleak baieztatu egin dira. Hala ere, herrialde hauen gehiengoak oso zabalak dira, eta haietako bakoitzak gene zenbaki kopuru handi bat barneratzen du. Horrek, egiazko gene inplikatua eta bere bariazio patogenikoen identifikazioa zailtzen duenak.
GZaren mapeo osoak ere bideratu egin dira, eta minberatasuneko geneen kokaleku posibleak ere ezagutzen dira. Ordea, hasieran esaten zen moduan, gizabanako baten arrisku genetiko erreala iragartzeko ahalmena oso mugatua izaten jarraitzen du.

Ikerketa genetikoentzako tresna berriak

Giza gaixotasunen analisi genetikoa erasotzeko gaur egun eskura ditugun tresnek, biologiaren aurrerakuntzetan zein teknologia berrien agerketetan oinarritzen dira. Hauek, informazio genetikoari buruzko kopuru handiak sortzea eragin du, baita datuen analisi eta gestioa eramateko irtenbide informatikoak ere. Garrantzitsua da, denbora hauetako aurrerapen adierazgarrienak aipatzea.

Giza genomaren proiektua:

Dudarik gabe, biologia modernoaren lorpen ikusgarriena, giza material genetikoa konposatzen duten nukleotidoen praktika guztiaren informazioa gure eskura jarri du. Oraindik garatzen ari den proiektua da, hainbat eskualde oraindik sekuentziatu gabe daudelako, batez ere kromosomen zentrometro eta telometroetan.

Genomaren sekuentziatzeak, gizaki guztien arteko %99,9aren identitatearen existentzia agerian jarri du. Modu honetan, gaixotasun “arruntak” sortzen dituzten determinante genetikoek, diabetesa bezala, %0,1a aldakorraren barruan aurkituko litzateke. Ere ezagutu ahal izan dugu, gizabanakoen arteko aldakuntza genetikoaren %90ak baino gehiagok, nukleotido baten polimorfismoei dagokie (Single Nucleotide Polymorphism edo SNP). Hauek, 300-400 nukleotidoen artean agertzen dira, geneetako eskualde kodifikatuetan(proteinan aldaketak sortuz), zein eskualde genetiko ez kodifikatuetan (bere adierazpena modulatzen dituzten introiak, splicing guneetan, eragiletan, etab.) edota adierazpen fenotipiko agerikoaren esparru intergenikoetan. 10.000.000 SNP baino gehiago existitzen direla estimatzen da, horietako gehienek neutro izanez. Hala ere, horietako hainbatek, fenotipoan eragin ditzakete. SNPak, markagailu genetikoaren beste multzo bat suposatzen dute, eta elkarketa gaixotasunen ikerketetan erabiliak izan daiteke. Aurrerantzean ikusiko dugunez, hauen genotipaketa posiblea izango litzateke gaur egungo teknologiarekin.

Bioinformatika:

Giza sekuentziatik eskuratutako informazio “gordinaren” kantitate handia, gene kodifikatzaileei buruz existitzen den ezagutzekin batera (bere estruktura, kokalekua…) pilatuta izaten da. Modu honetan, data base ikaragarriak sortzen dira, non, aldez aurretik ezagututako geneaz aparte, algoritmo informatikoen bitartez, laborategian oraindik ez aldendutako geneen kokalekua eta estrukturaketa (posibleko funtzioa baita) iragartzen da; ohar genetika izena hartzen duena. Data base hauek, bilatzaile eta Internetako tresna abegitsuak eskaintzen dute.

Bi garrantzitsuenak ondorengoak dira: Entrez izendaturiko tresna, estatubatuar Osasun Institutu Nazionalak (NIH) ( www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/ ) gestionaturikoa. Hau, data base klasikoenak ere elkartzen ditu; hala nola, GenBank, OMIM eta PubMed, beste batzuen artean. Bestalde, Institutu Bioinformatiko Europearrak (EBI-EMBL) gestionatzen duen plataforma, Sanger Institutu Britanikoarekin batera ( www.ensembl.org ). Informazio erabilgarriaren artean, genomaren sekuentzia gordin bera aurkitzen da, gene kodifikatzaileen oharpena (eragileak, exoiak, introiak, prozedura alternatiboak, etab.), sekuentziatuak izaten ari diren beste espezieekiko homologia, eta aldakuntza genetiko guztia (SNPak), ikertuta izaten ari diren giza biztanleriaren polimorfismo hauen frekuentzia alelikoak barne.

Microarraysen adierazpen genetikoa:

Nanoteknologiaren eskutik, determinazioak bideratzeko egiten diren erreakzio biokimiken bolumen fisikoa modu ikaragarrian murriztu izan da. Gaur egun, microarrays edo mikrotxipak erabiliz, aldi berean,  mikroskopia porten esparruan, askotariko erreakzioak burutzen dira. Aldakuntzarik erabilienetariko bat, adierazpen genetikoaren microarrays-ak dira. Hauetan, lagin biologikoaren RNA-ren mandatari isolatua analizatzen da, genoma osoaren transkripzioaren maila determinatu ahal izateko (30000 giza geneak, adibide baterako). Honek transkriptoma izendatu egiten da. Gaixotasun batean eragin ahal duten gene hautatuak identifikatzeko bideratutako saiakuntza bat diseinatzea posiblea da. Honetan, genoma osoaren adierazpena bideratzen da, ehundura gaixoaren laginak, ehundura osasuntsuen laginekin konparatuz, microarrays-a adierazgarri moduan erabiliz.

Bi egoera konparatuetako adierazpen maila ezberdinak antzezten dituzten geneak, gaixotasunaren garapenean potentzialki inplikatuak egongo dira. Informazio nabarmena (data mining) ateratzeko eta modu ulergarri eta koherentean (adierazpen bereizgarria, adibidez) antzezteko tresna informatikoak ere garatu egin dira. Analisiaren beste maila altu batek, gene indibidualen zerrendaketen harantzago joatea suposatuko luke. Baita geneetako (edo haien produktuetako) interakzioei buruzko ezagutza izatedunak erabiltzea, bide metabolikoetan edota prozedura zelularretan multzotzeko. Hau, lagungarria izan daiteke diana terapeutikoen bilaketan edo microarray-an aldarrikatuak agertzen diren geneen transkripzioan.

Bestalde, ehun batean sintetizaturiko proteinen multzoaren (proteomika) ikerketaren garapenerako tresnak garatu egin dira. Produzituriko metabolitoak (metabolomika) baita garatu egin dira, baina bere konplexutasun esperimentala dela eta, askoz gutxiago garatu egin dira, eta haien erabilera gutxiz estandarizatuagoa dago. Hala ere, planteamendu berberari agindu egiten diote, eta diseinu esperimentalak, Transkriptomikak erabiltzen dituen analogoak dira.

Genotipaketa:

DNAren bitarteko datu genotipikoak lortzeko ahalmenean baita aurrerapenak produzitu egin dira. Momentu honetan, gizabanako baten DNAren laginaren bitartez, aldibereko 500000 SNP   genotipatzeko ahalmena daukagu; genotipaketa masiboarekiko mikrotxipen erabileraren bitartez. Baliabide ekonomiko nahikoekin kontatzen bada, eta gaixoen DNAren bilduma handiarekin eta kontrolekin kontatzen bada, genoma osoa barneratzen duen asoziazio ikerketa bat burutzea posiblea izango litzateke, iragan berrian emandako gene hautatuaren ikerketak ordezkatuz.

Estrategia berrian diseinua:

Gaixotasun Zeliakoaren estrategia funtzionala:

Gaixotasun autoinmuneentzako determinatzaile genetiko berriak identifikatzeko saiakuntzan, gaixotasun honen diagnostikoa, pazienteen heste-biopsian oinarritzen dela aprobetxatu egin dugu eta microarrays-en genoma osoaren adierazpenaren ikerketak burutu egin ditugu, hautatu posible funtzionalak identifikatzeko helburuarekin. Konkretuki, GZan berriak diren pazienteen heste-ehunen adierazpena analizatu egin dugu (oraindik gluten kontsumitzen dutenean) , eta bi urte baino gehiagoko glutenik gabeko dieta eramaten duten pazienteen heste-ehun biopsiekin konparatu egin dugu. Pazientea asintomatikoa denean, ez ditu heste-lesiorik ezta autoantigorputz zirkularrik aurkezten. Modu honetan, glutenarekiko adierazpen kronikoa aldaturik dituzten, eta gaixotasunaren fase aurreratuetan ikusi ahal diren geneak identifikatu nahi izan dugu. Bestalde, zeliakodun trataturiko pazienteen biopsien taldeetan, hauek, bi zatitan banandu egin ziren, lau ordutan zehar, erdi batek gari-gliadinarekin inkubatuz eta bestea proteina hau barik.  Biopsia hauen adierazpenak aztertu egin ziren, eta modu honetan, glutenarekiko esposizio zorrotza zituzten geneak alterazioak sufritzen zituztenean behatu ahal izan ziren. Hauek, erantzun autoinmunearen hasierekin nahasiak egotea posiblea izango litzateke. Microarrays-en analisi honetan, glutenarekiko adierazpen zorrotzera lotutako milaka gene baino gehiago aurkitu egin ziren. Horietako guztietatik, bide metabolikoen data baseak eta prozedura zelularrak analizatuz gero, patogenia autoinmunean parte hartzen duten bide nabarmenak hautatu egin dira (apoptosia, seinaleztapen zelularra, zitokinak, etab.) Beranduago, informazio hau, azken urteetan argitaraturiko mapeo genomikoekin gurutzatu egin da, genomaren eskualde beroekin bat egiten dituzten gene hautatu funtzionalen lista lortu ahal izateko. Azkenik, polimorfismoen (SNP) selekzio prozesu bat bideratu egin da, aldaketa funtzionalaren iragartze tresna informatikoak erabiliz. Honekin batera, irizpide genetikoak aurkituko litzateke (espezie ezberdinetan kontserbatzea, ligamenduaren desorekaren patroiak, etab.) Modu honetan, paziente eta kontrolekin konparatutako ikerketa  genetiko batean aztertuak izango diren 384 polimorfismoen listatze bat lortu egin dugu. Iragan hurbilak, estrategia hau zuzena izan dena esango digu.

Diabetes mota 1eko estrategia jarrera

Hego-Europaren herrialdeetan, DM1 eta GZ arriskua dituzten determinante genetikoetan, HLA-DR3-DQ2-en haplotipoak aurkitzen dira. Haplotipo hauentzako pazienteen bi gaixotasunen konparaketan, diabetikoek dituzten haplotipoen HLA-A*30 y HLA-B*18 aleloak ere barne daude. Honek, herrialdeen genetikari dagokionez, haplotipo AH18.2ri dagokio, eta zeliakoetan AH8.1 haplotipoa nagusi da. Honek, haplotipo 18.2an HLA-DR3-DQ2ren aparte, beste faktore diabetogeniko bereizia existitzen dela esan nahi du; diabetogenikoagoa bihurtuko zukeena. 5Mbko eskualde masibo baten ikerketa genotipatu batek, MHCko eskualdean, paziente hauetan 2360 SNPak aztertuz gero, 18.2 haplotipoan aldakuntzarik ematen ez direla konfirmatu zen. Haplotipo honek, kontserbazio izugarria aurkezten du eta haplotipoaren alelo diabetogeniko posiblea, honen kopia guztietan ezarrita egongo litzatekeela aditzera ematen du. HLA-DR3-DQ2 (AH-8.1 bezalako) haplotipoek, bere partez, aldakuntza maila altua aurkezten dute. Honek, haietariko hainbatek alelo diabetogenikoa barneratu ditzaketela esan nahi du.  Egoera hau, DR3 haplotipoen diabetogenikotasun maila baxuenarekin bat egiten du, eta hego Europako HLA-DR3ren baxuko diabetesaren elkartearekin ere. MHC eskualdean bigarren gene diabetogeniko hau lokalizatzeko hartu dugun estrategia, paziente diabetikoak eta kontrolak konparatzea da, hauek guztiak HLA-DR3-DQ2homogozitoak eta haplotipo AH-18.2 haplotipoaren kopiaren garraiatzaileak izanez; bi taldetan guztiz berdina izango dena.
5Mbko atalen 2360 SNPak analizatuz gero, gure helburua gaixotasunarekin harremanaturiko beste haplotipoaren polimorfismoak identifikatzea da. Momentura arte, asoziazio indartsua azaltzen dituzten bi eskualde identifikatu ditugu (58 eta 10 Odds Ratio, hurrenez hurren). Hauek, barnerakoitasuneko bigarren gene hau barnera ditzakete. Gaur egun, lagin bakar batean emaitza hauek baieztatzea beharrezkoa da, eta inplikaturiko genea (edo geneak) zehaztasunez lokalizatzea.

Inbestigazio hainbat taldek eta gu geuk burutzen ari garen ikerketa hauekin, markagailu genetiko berraik identifikatzea espero dugu, tresna fidagarri eta eraginkorrekin kontatu ahal izateko. Modu honetan, gaixotasun autoinmune hauetako iragarpena eta posibleak izango litzatekeen dianak identifikatu ahal izateko, joera prebentibo bat burutzeko asmoz.

¡No se ha encontrado ninguna etiqueta!
Regeresar
Nuestro Facebook

Asociación Celíacos Euskadi.